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美國Biozellen3D細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)膠使用步驟：

A、試劑制備

A基質(zhì)膠：將A基質(zhì)膠溶于37℃水浴槽回溫10分鐘， 確認(rèn)*融解.

C緩沖溶液(1X)制備：使用前將10X C緩沖溶液用冰的無細(xì)胞培養(yǎng)液(例如： 無血清DMEM、opt-MEM) 制備成 1X C 緩沖溶液。(不要用 PBS 稀釋 C 緩沖液) .

D 緩沖溶液(1X)制備: 使用前用冷的 1x PBS 稀釋 10X D 緩沖溶液至 1X D 緩沖溶液.

B、Biozellen®3D細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)膠的制備

全部步驟需要在無菌環(huán)境內(nèi)操作，操作步驟如下：

1. 將24孔培養(yǎng)板放置于冰上預(yù)冷半小時(shí)。

2. 細(xì)胞計(jì)數(shù)后取 2×105~2×107 細(xì)胞與 0.5 毫升 37℃ 細(xì)胞培養(yǎng)基均勻混合，并與0.5毫升37℃ A膠按照 1:1 等比例均勻混合，最終細(xì)胞密度1*105~1*107cells/mL。

注：請(qǐng)選擇適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)溶液與條件進(jìn)行試驗(yàn)。

3.取 20-40 微升步驟 2的混合液滴于 步驟 1 預(yù)冷的培養(yǎng)板上，膠體將于 5 分鐘內(nèi)成膠。 注: 測(cè)試膠體是否成膠，可用微量吸管尖溫和的觸碰膠體表面進(jìn)行確認(rèn)。

4.待膠體成膠后，添加1毫升冰的1X C緩沖溶液，并蓋過步驟3 的膠溶液，固定 15 分鐘。

5.待15分鐘固定后，小心的吸取 C 緩沖溶液并置換為適合此細(xì)胞生長之培養(yǎng)基溶液。

6將含有細(xì)胞的膠于37°C 二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行7~14天的培養(yǎng)，并觀察細(xì)胞球體的形成，按正常培養(yǎng)基更換頻率進(jìn)行更換操作。

C、溶膠與收集細(xì)胞球體準(zhǔn)備程序

小心的將培養(yǎng)基吸取移除，并用1X PBS進(jìn)行清洗。

小心的將 1X PBS 吸取移除，并添加 1 毫升冰的D緩沖溶液，蓋過膠滴于室溫反應(yīng) 5分鐘。

溫和的用1毫升移液管吸取，直到膠滴*溶解。

將含有細(xì)胞球體的溶液吸入1.5 毫升離心管，用1000 rpm的轉(zhuǎn)速離心10分鐘，移除上清液體并收集細(xì)胞球體做分析。

D、收集單顆細(xì)胞準(zhǔn)備程序

在分離單細(xì)胞前，先按上述溶膠與收集細(xì)胞球體準(zhǔn)備程序進(jìn)行操作

1. 添加trypsin-EDTA并與收集的細(xì)胞球體于37°C混合反應(yīng)。

2. 用1毫升移液管混合，直到細(xì)胞體*分解。

3. 待細(xì)胞球體*分解，加入3倍體積的1X PBS，并用1000轉(zhuǎn)的轉(zhuǎn)速進(jìn)行離心10分鐘，并移除上清液體收集沉淀的單細(xì)胞做分析。

E、細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備程序

1. 準(zhǔn)備Transwell裝置及無血清DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液 (用于稀釋A膠)。

2. A膠 (2X) (貨號(hào):B-P-00002-A) 置于37 ℃水浴槽回溫10分鐘，確認(rèn)*融解。

3. 用無血清DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液將A膠 (2X)稀釋50倍。

4. 根據(jù)Transwell上室底部面積加入100-120 ul/cm2稀釋后的A 膠稀釋液到Transwell上室中。

5. 將步驟4在4 ℃冰箱孵育30分鐘。

6. 將多余的稀釋液吸出，并在Transwell上室中加入無血清的癌細(xì)胞系細(xì)胞懸浮液使細(xì)胞濃度約7.5 x 104 cells/well.。

7. 在Transwell下室中加入含10 %血清的細(xì)胞培養(yǎng)液做為chemoattractant，吸引癌細(xì)胞系進(jìn)行遷移。

F、小鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備程序

1. 將 A膠 (2X) (貨號(hào):B-P-00002-A) 置于37 ℃水浴槽回溫10分鐘，確認(rèn)*融解。

2. 將C緩沖溶液(10X) 貨號(hào):B-P-00002-C)與冰的無血清細(xì)胞培養(yǎng)液 (例如: 無血清DMEM或內(nèi)含VEGF、heparin的無血清DMEM) 按1:4比例均勻混合配置。(例如:1 ml C緩沖溶液(10X) 與 4 ml 無血清DMEM混合，不可用PBS稀釋)

3. 將 A膠 (2X) 與約2*106 cells/ml的癌細(xì)胞系懸浮液按1:1等比例均勻混合配置，癌細(xì)胞系懸浮液最終濃度約為106 cells/ml。

4. 選用21-25 G的針頭 (避免破壞細(xì)胞)，抽取0.2-0.3 ml 預(yù)冷稀釋后的C緩沖溶液。(C緩沖溶液用于A膠成膠反應(yīng))

5. 使用步驟4的同一支針管，再抽取0.1-0.7 ml含細(xì)胞的A膠混合液，在冰上孵育五分鐘。

6. 以皮下注射方式注射0.3-1.0 ml至小鼠。(需一次注射完含C緩沖溶液的A膠混合液)

注1: 注射體積可依不同實(shí)驗(yàn)?zāi)康淖稣{(diào)整，若為血管生成研究注射體積需至少0.5 ml。

注2: 此步驟依實(shí)驗(yàn)需求可執(zhí)行或不執(zhí)行，若需呈現(xiàn)明顯的皮下注射隆起效果，可于注射完畢后，在小鼠注射部位冰敷5-10分鐘

，若需呈現(xiàn)明顯的皮下注射隆起效果，可于注射完畢后，在小鼠注射部位冰敷5-10分鐘。

7. 培養(yǎng)一至三周后可摘取接種的腫瘤組織。

注3: 若為血管生成研究，應(yīng)注射含VEGF及heparin的A膠，以促進(jìn)血管生成。約三天后，可摘取含有新血管生成的腫瘤組織。